Células estromais mesenquimais alogénicas derivadas do cordão umbilical melhoram a função motora na reparação cirúrgica pré-natal do mielomeningocelo: estudo em modelo ovino (resumo do estudo)

Principais pontos e resultados:

Este estudo pré-clínico foi realizado em fetos de ovelha. Nenhuma criança foi tratada. Uma equipa francesa de Paris, que se prepara para acrescentar células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical (UC-MSC) à reparação cirúrgica pré-natal do mielomeningocelo, colocou durante a reparação um patch de fibrina com UC-MSC de ovelhas dadoras sobre a medula espinal exposta de fetos de cordeiro. Os cordeiros reparados com o patch com células foram comparados com cordeiros reparados com o mesmo patch sem células.

Um dia após o nascimento, os cordeiros que tinham recebido células moviam-se melhor, nenhum tinha perdas de urina e, ao microscópio, as suas medulas espinais tinham mais células nervosas grandes e muito menos tecido cicatricial. Estas diferenças foram estatisticamente significativas. Outras medidas, incluindo os testes de condução nervosa, o tamanho dos músculos e a espessura dos esfíncteres, não mostraram diferença. Só nove cordeiros nasceram vivos e foram seguidos durante 24 horas, pelo que o estudo nada diz sobre efeitos ou segurança a mais longo prazo.

Objetivo:

Investigar o efeito de um patch de UC-MSC alogénicas (de dador) aplicado durante a cirurgia fetal sobre a função motora e esfincteriana às 24 horas de vida no modelo ovino de mielomeningocelo.

Métodos:

O estudo foi aprovado pela Comissão Nacional Francesa de Investigação Animal e seguiu as diretrizes ARRIVE para a investigação em animais.

As UC-MSC foram cultivadas pelo método de explante a partir dos cordões umbilicais de três cordeiros nascidos por cesariana perto do termo. As células eram fusiformes, aderiam ao plástico e tinham os marcadores de CEM de ovelha CD29, CD90, CD73, CD44 e CD166, mas não CD31 nem CD45. Para cada patch com células, 17 milhões de células na passagem 5 foram misturadas com fibrinogénio de um kit comercial de selante de fibrina (Evicel) e solidificadas com trombina. Os patches de controlo foram feitos da mesma forma, sem células. Ambos os tipos eram flexíveis e tinham cerca de 2 mm de espessura.

Foi criado cirurgicamente um defeito da coluna em fetos de cordeiro ao dia 75 de gestação (laminectomia de L1 a L5 com remoção da dura-máter), reparado ao dia 89. O patch foi colocado sobre a medula espinal e a pele fetal foi fechada por cima. Os cirurgiões sabiam que patch era usado. Os cordeiros nasceram por cesariana ao dia 140 a 142 e foram mantidos vivos durante 24 horas.

Às 2 e às 24 horas de vida, um médico de reabilitação pediátrica e um cirurgião veterinário, ambos sem conhecimento do grupo, avaliaram o movimento com a escala Sheep Locomotor Rating (SLR, de 0 para paralisia completa a 15 para normal), bem como a capacidade de se pôr de pé, os reflexos, a sensibilidade e a atrofia muscular (amiotrofia). Um cordeiro era considerado continente se adotasse uma postura normal de micção e não tivesse perdas quando a bexiga era pressionada. Às 24 horas, sob anestesia, um neurologista veterinário sem conhecimento do grupo registou a atividade elétrica muscular, a condução nervosa e os potenciais evocados medulares, e uma tomografia da coluna mediu o tamanho do defeito. Os cordeiros foram depois eutanasiados. Um neuropatologista sem conhecimento do grupo mediu a área da medula espinal, a área da substância cinzenta, a densidade de neurónios grandes e a espessura do tecido cicatricial (fibrose), e todos os órgãos principais foram examinados quanto a tumores.

O estudo foi planeado com quatro cordeiros por grupo, assumindo que 90% dos cordeiros tratados e 10% dos de controlo teriam uma pontuação acima de 12 na SLR. Os grupos foram comparados com o teste U de Mann-Whitney e o teste do qui-quadrado.

Resultados:

Foram colocados patches em 13 fetos. Perderam-se quatro: dois abortos (um em cada grupo) e duas mortes fetais, uma descoberta no momento da reparação e um feto tratado na cesariana. A perda fetal global foi de 31%. Nasceram vivos nove cordeiros, 5 com patch com células e 4 com patch de controlo.

Segurança: as nove reparações estavam completamente cicatrizadas. Nenhum cordeiro tinha herniação do rombencéfalo, e não foi encontrado nenhum tumor em nenhum órgão. As causas das quatro perdas fetais não puderam ser determinadas porque não foi possível fazer autópsia.

Movimento:

• SLR às 2 horas: mediana de 2 (intervalo de 1 a 7) com células contra 2 (1 a 6) sem células, p = 0,83.
• SLR às 24 horas: mediana de 14 (intervalo de 13 a 15) com células contra 5 (4 a 14) sem células, p = 0,04.
• Capazes de se pôr de pé sem ajuda: 5 de 5 com células, 2 de 4 sem células, p = 0,07 (não significativo).
• Atrofia muscular nos membros posteriores: 0 de 5 com células, 3 de 4 sem células, p = 0,02.

Continência: nenhum dos 5 cordeiros tratados era incontinente, contra todos os 4 cordeiros de controlo (p = 0,002). Os autores referem que se tratou de uma simples avaliação clínica, não confirmada por testes da bexiga nem por histologia.

Testes nervosos e tomografias da coluna: a atividade elétrica muscular espontânea, as amplitudes e velocidades de condução nervosa e os potenciais evocados medulares não diferiram significativamente entre grupos. As tomografias mostraram defeitos de tamanho e angulação da coluna semelhantes nos dois grupos.

Medula espinal ao microscópio:

• Densidade de neurónios grandes: 14,5 por mm² de substância cinzenta com células contra 5,6 sem células (p = 0,001).
• Tecido cicatricial entre a medula espinal e a pele: 453 contra 3921 micrómetros de espessura (p = 0,03).
• Tecido cicatricial à volta da medula espinal: 47 contra 158 micrómetros de espessura (p = 0,0001).
• A área da substância cinzenta (8,2 contra 7,1 mm², p = 0,74) e a área da medula espinal (21,8 contra 16,7 mm², p = 0,44) não diferiram significativamente.

Músculos e esfíncteres: o peso e o tamanho das fibras de dois músculos dos membros posteriores e a espessura dos esfíncteres urinário e anal foram semelhantes nos dois grupos.

O artigo tem algumas incoerências de apresentação. O texto chama “médias” a vários resultados, enquanto as tabelas e os métodos indicam medianas. Alguns intervalos na tabela dos resultados extramedulares não podem estar corretos (por exemplo, uma mediana de controlo de 13,7 com um intervalo de 45,3 a 49,4), e a tabela das tomografias repete os números das linhas do peso muscular. Isto não afeta os principais resultados acima.

Conclusões:

Os autores concluem que os patches de UC-MSC usados em conjunto com a reparação pré-natal do mielomeningocelo em ovelhas “melhoram as funções motora e esfincteriana”, a par de uma melhor preservação da medula espinal e de menos fibrose, e que são necessários mais estudos sobre a segurança a longo prazo e sobre a possibilidade de transpor a abordagem para humanos.

Limitações referidas pelos autores:

• Amostra pequena, em parte devido à perda fetal, frequente neste modelo animal.
• Seguimento de apenas 24 horas, porque cuidar de cordeiros possivelmente com deficiência é caro e complexo, o que limita as conclusões sobre eficácia, tolerabilidade e segurança.
• Uma medida subjetiva da continência, não confirmada histologicamente.
• Os testes de condução nervosa e de potenciais evocados não mostraram diferença, possivelmente porque o estudo era demasiado pequeno ou porque os circuitos nervosos diferem entre ovelhas e humanos.

Outros pontos pedem também cautela. Os cirurgiões conheciam o grupo de cada feto. A capacidade de se pôr de pé não foi significativamente diferente. O resultado de movimento às 24 horas assenta em 5 contra 4 animais, e um cordeiro de controlo teve uma pontuação de 14, igual à mediana dos tratados.

Diferenças em relação ao estudo da equipa com células humanas: o mesmo grupo repetiu mais tarde a experiência com UC-MSC de cordões umbilicais humanos (resumo do estudo). Neste estudo anterior, as células vinham de ovelhas, o movimento e a continência diferiram significativamente às 24 horas e o tecido cicatricial foi significativamente reduzido, enquanto a área da medula espinal e da substância cinzenta não diferiu. No estudo com células humanas, o padrão foi quase o inverso. A área da medula espinal, a área da substância cinzenta e a densidade de neurónios foram significativamente melhores, mas os resultados de movimento e a redução do tecido cicatricial não atingiram significância. Os autores do estudo posterior sugeriram que os três cordões de dadores humanos podem ter produzido menos fatores protetores. Ambos os estudos foram pequenos e seguiram os cordeiros durante apenas 24 horas.

Informação de contexto:

Os autores referem que, mesmo após a cirurgia fetal, 71% das crianças com mielomeningocelo não conseguem andar de forma independente aos oito anos e 75% precisam de cateterização urinária diária aos dez anos. A experiência anterior da equipa em ovelhas encontrou apenas um efeito pequeno e não significativo das UC-MSC sobre o movimento às 2 horas de vida, o que consideram ter sido demasiado cedo após o nascimento para avaliar.

Um grupo da Califórnia que usou CEM da placenta do início da gestação sobre uma matriz porcina no mesmo modelo relatou uma SLR mediana de 15 com células contra 6 sem células, e mais neurónios preservados. Esse grupo não encontrou diferença na função da bexiga, pelo que o resultado sobre a continência neste estudo é novo e não está confirmado.

Os autores pensam que as UC-MSC atuam sobretudo libertando fatores de crescimento e fatores protetores, e não transformando-se em células nervosas, mas afirmam que os mecanismos exatos ainda não são conhecidos. Sugerem que a redução do tecido cicatricial pode ser relevante para a medula presa, um problema frequente após a reparação do mielomeningocelo. Num estudo anterior de rastreamento do grupo, as células transplantadas não foram encontradas em órgãos distantes.

O estudo foi financiado por duas instituições francesas de beneficência para a investigação médica, a Fondation de l’Avenir e a Fondation pour la Recherche Médicale. Os autores declararam não ter conflitos de interesse. A revista publicou um comentário de Anna L. David a acompanhar o artigo.