As células estromais mesenquimatosas imunomoduladoras derivadas do âmnio preservam a função muscular num modelo de ratinho da distrofia muscular de Duchenne

Principais pontos e resultados:

Este é um estudo em animais. Nenhum doente foi tratado. Uma equipa japonesa da Universidade de Tóquio, da Nippon Medical School e da Kaneka Corporation administrou células estromais mesenquimatosas derivadas do âmnio humano (hAMSC) a ratinhos mdx, o modelo de ratinho padrão da distrofia muscular de Duchenne, por injeção repetida na veia da cauda, e acompanhou os ratinhos até um ano.

Para uma família que pondere um tratamento, o artigo mostra que estas células acalmam o sistema imunitário em laboratório, empurrando os macrófagos para o tipo anti-inflamatório M2, que doses intravenosas repetidas foram toleradas pelos ratinhos e reduziram a inflamação muscular, e que os ratinhos tratados mantiveram mais força de preensão, correram mais longe e tiveram uma função cardíaca ligeiramente melhor ao fim de um ano. Não mostra que algo disto aconteça em crianças. As células eram derivadas do âmnio, não as células derivadas do cordão umbilical usadas no nosso próprio programa, e não restauraram a distrofina, a proteína em falta que causa a doença. As células foram fornecidas pela Kaneka Corporation, que financiou parcialmente o trabalho e emprega quatro dos autores.

Objetivo:

Testar se as hAMSC polarizam macrófagos humanos para o tipo M2, e se a injeção sistémica repetida de hAMSC, dada precocemente na doença, melhora a função do músculo esquelético e cardíaco em ratinhos mdx.

Métodos:

Células. O âmnio foi colhido, com consentimento, das membranas fetais de mulheres submetidas a cesariana. As células foram isoladas por digestão enzimática, expandidas, congeladas e usadas entre as passagens 1 e 5. Apresentavam os marcadores habituais das células estaminais mesenquimatosas (CD73, CD90, CD105), não tinham CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 e HLA-DR, e formaram osso e cartilagem em cultura, mas não gordura.

Trabalho de laboratório. Células mononucleares de sangue humano foram co-cultivadas com hAMSC na proporção de 20 para 1 e os marcadores de macrófagos foram medidos por citometria de fluxo e qPCR, com indometacina usada para bloquear a prostaglandina E2 (PGE2).

Animais. Ratinhos mdx machos, de fundo C57BL/10, foram divididos aleatoriamente em grupos de controlo e tratados. Cada dose foi de 8,0 × 10⁵ hAMSC em 100 µL de soro fisiológico na veia da cauda, uma vez por semana, a partir das 4 a 5 semanas de idade. O braço de curto prazo recebeu quatro doses (n = 10, avaliados às 12 e 18 semanas de idade, contra 14 mdx de controlo e 7 ratinhos de tipo selvagem). O braço de longo prazo recebeu quatro doses (n = 6) ou seis doses (n = 4) e foi avaliado ao fim de um ano contra 12 mdx de controlo e 7 ratinhos de tipo selvagem. Muitos resultados foram medidos em subconjuntos de 3 a 8 ratinhos, indicados abaixo. O resultado primário pré-especificado foi a função motora a longo prazo (força de preensão dos membros anteriores e velocidade de corrida); a histologia foi secundária. Os investigadores não podiam estar em ocultação quanto à estirpe do ratinho; a corrida foi registada por uma roda automática durante cinco dias. Os dados foram excluídos quando um ratinho tinha perdido peso, estava ferido ou debilitado, ou quando um valor era considerado peculiar.

Resultados:

Efeitos imunitários na placa. As hAMSC reduziram a proliferação de células T ativadas de 90,1% para 59,9% (p inferior a 0,0001) e secretaram PGE2. A proporção de células CD206 positivas (M2) subiu modestamente, de 11,3% para 14,2% (p = 0,035), enquanto as células M1 não se alteraram. A indometacina aboliu a subida de CD206, apontando a PGE2 como mediador.

Tolerabilidade. O peso corporal não diferiu entre ratinhos mdx tratados e não tratados em nenhum momento. Não são reportadas outras medidas de segurança (exame de órgãos, rastreio de tumores, reação imunitária às células humanas).

Curto prazo (12 a 18 semanas de idade, quatro doses):

• A creatina cinase sérica, o marcador de fuga muscular, estava mais baixa quatro semanas após a última dose (435 ± 79 vs 583 ± 92 ng/mL, p = 0,038, n = 6 vs 4), mas não às dez semanas (582 vs 700 ng/mL, p = 0,228). Os autores chamam-lhe transitória.
• IL-6 no músculo tibial anterior: 10,0 ± 3,8 vs 94,2 ± 64,1 pg/mL (p = 0,002, n = 4 vs 5).
• Força de preensão às 12 semanas: 336,8 ± 21,0 g vs 280,0 ± 37,8 g (p = 0,0008; normalizada para o peso corporal 10,3 vs 8,8 g/g, p = 0,012; n = 10 vs 14).
• Área de macrófagos (F4/80) no diafragma: 14,0% vs 19,5% (p = 0,013, n = 4 vs 3). A proporção de macrófagos com o marcador M2 CD206 no tibial anterior subiu de 17,6% para 55,5% (p inferior a 0,0001).
• Foram encontradas células humanas no tibial anterior quatro semanas após o tratamento, ocupando apenas 0,0036% da área do corte, e tinham desaparecido às dez semanas. A distrofina não foi detetada, pelo que as células não repararam o defeito subjacente.

Longo prazo (um ano, quatro ou seis doses, geralmente agrupadas):

• Infiltração de células mononucleares no tibial anterior: 9,0% nos controlos, 7,3% após quatro doses, 4,7% após seis; apenas o grupo de seis doses atingiu significância (p = 0,038, n = 4 por grupo tratado vs 14). Sem diferença no diafragma.
• Fibras com núcleos centrais, um sinal de degeneração e regeneração repetidas: 64,3% vs 82,0% (p = 0,014, n = 5 vs 7).
• A fibrose não foi reduzida no tibial anterior, no diafragma nem no coração.
• Força de preensão: 296,5 ± 27,2 g vs 265,7 ± 26,3 g (p = 0,049; normalizada 8,6 vs 7,3 g/g, p = 0,002; n = 8 vs 12). Os ratinhos de tipo selvagem tiveram 336,4 g, pelo que os ratinhos tratados ficaram entre os dois.
• A velocidade máxima de corrida não foi diferente (21,6 vs 20,5 m/min, p = 0,77). A distância diária de corrida foi maior (3.649 ± 1.025 vs 2.420 ± 788 m/dia, p = 0,028, n = 8 vs 10), assim como a distância média por minuto (18,3 vs 14,7 m/min, p = 0,047, n = 5 vs 5).
• Coração: sem diferença na morfologia macroscópica, na fibrose ou na polarização dos macrófagos, mas menos infiltração mononuclear (n = 6 vs 6) e encurtamento fracionário do ventrículo esquerdo mais alto, 37,0 ± 2,3% vs 33,6% (p = 0,017; tipo selvagem 39,6%). O cabeçalho da Tabela 2 indica 8 ratinhos tratados, enquanto a nota de rodapé e a legenda da figura dizem 5, uma incoerência do próprio artigo.

Conclusões:

Os autores concluem que o tratamento sistémico precoce e repetido com hAMSC atrasou a inflamação e o declínio motor em ratinhos mdx, provavelmente através da polarização de macrófagos M2 e não por as células se transformarem em músculo. Sugerem que poderia ser combinado com esteroides ou com terapia génica.

Limitações indicadas pelos autores:

• A doença cardíaca em ratinhos mdx é ligeira em comparação com os doentes, pelo que os resultados cardíacos dão informação limitada sobre humanos. Propõem confirmá-lo no modelo canino.
• As células humanas persistiram apenas brevemente, e o modo como os fatores secretados produzem efeitos duradouros não está estabelecido; o mecanismo está por esclarecer.
• A cultura e a expansão prolongadas de células estaminais mesenquimatosas acarretam riscos de senescência e de alteração cromossómica, e a capacidade imunossupressora varia com a fonte do tecido.
• Dos métodos: os investigadores não estavam em ocultação quanto à estirpe, alguns dados foram excluídos por julgamento e os grupos de longo prazo eram pequenos.

Informação de contexto:

A Duchenne afeta cerca de 1 em cada 3.500 nascimentos do sexo masculino. Os esteroides são o tratamento anti-inflamatório padrão, mas as respostas variam e os efeitos secundários são frequentes. A mesma equipa relatou anteriormente que células estaminais da polpa dentária por via intravenosa repetida mantiveram a atividade locomotora em ratinhos mdx e cães distróficos. Os autores notam que as células estaminais mesenquimatosas administradas por via intravenosa ficam em grande parte retidas nos pulmões e aí morrem, e que o seu efeito imunitário parece resultar do modo como os fagócitos do próprio recetor respondem às células moribundas. O artigo não contém dados de células derivadas do cordão umbilical e não menciona nenhum ensaio em humanos de células derivadas do âmnio para a Duchenne.