Terapia in vivo para a reparação pré-natal do mielomeningocelo no modelo fetal ovino com células estaminais mesenquimais humanas derivadas do cordão umbilical: prova de princípio (resumo do estudo)

Principais pontos e resultados:

Este é um estudo em animais, em cordeiros por nascer. Nenhum humano foi tratado. Uma equipa do Centro Médico Universitário de Hamburgo-Eppendorf, na Alemanha, criou um defeito de espinha bífida (mielomeningocelo) na coluna de fetos de cordeiro e reparou-o depois no útero, tal como os cirurgiões fazem na cirurgia fetal humana. Em alguns cordeiros, colocaram primeiro células estaminais mesenquimais (CEM) humanas do cordão umbilical diretamente sobre a medula espinal exposta. As células vinham do Desacell, um produto pronto a usar feito a partir do tecido do cordão umbilical de um único recém-nascido saudável. Os estudos anteriores em ovelhas tinham usado células semeadas num patch, pelo que este foi o primeiro relato da aplicação desta forma de uma suspensão líquida de células.

O estudo mostrou que as células puderam ser aplicadas nos cinco cordeiros previstos para as receber. Não conseguiu mostrar se as células ajudaram. Só três dos sete cordeiros operados nasceram vivos (dois tratados, um não tratado), os três tinham pontuações de movimento normais ou quase normais, e o cordeiro não tratado foi na verdade o que teve a maior densidade de células nervosas grandes sobreviventes. Os próprios autores afirmam que a amostra era demasiado pequena para qualquer comparação entre grupos.

Objetivo:

O objetivo principal foi testar se um produto pronto a usar de CEM humanas do cordão umbilical (Desacell) podia ser aplicado localmente sobre a medula espinal durante a reparação fetal da espinha bífida em ovelhas. Os objetivos secundários foram ver se as células melhoravam o movimento na escala Sheep Locomotor Rating (SLR), se aumentavam o tamanho da medula espinal e da sua substância cinzenta, e se a densidade de células nervosas grandes se relacionava com o movimento.

Métodos:

Foram usadas ovelhas gestantes de um único criador, todas com cordeiros do mesmo carneiro. O estudo foi aprovado pela autoridade estadual de Hamburgo ao abrigo da Lei Alemã de Proteção dos Animais.

Por volta dos 75 dias de gravidez (uma gravidez de ovelha dura cerca de 145 dias), os cirurgiões abriram o útero, removeram a pele, os músculos das costas e os arcos ósseos da coluna de L1 a L5, e abriram a membrana que cobre a medula espinal. Isto deixa a medula exposta ao líquido amniótico, imitando a espinha bífida. Cerca de 25 dias depois, os cordeiros fizeram uma segunda operação para reparar o defeito. Os cordeiros foram atribuídos na proporção de dois para um à reparação com ou sem células. No grupo das células, o tecido cicatricial sobre a medula espinal foi removido e foi aplicado diretamente sobre a medula 1 mL de suspensão em gel de Desacell com 30 milhões de células. Todos os cordeiros receberam depois um patch multicamada e o encerramento da pele. Nas gestações gemelares, um gémeo foi tratado e o outro serviu de controlo ou não foi operado.

As células vinham de um único cordão umbilical de dador, cumpriam os critérios internacionais de identidade das CEM e foram testadas quanto à esterilidade, micoplasma e endotoxinas. Foram descongeladas, lavadas, contadas e enviadas refrigeradas (4 °C) para o local da operação.

Os cordeiros nasceram a termo e foram filmados às 2 e às 48 horas após o nascimento. Avaliadores que não sabiam que cordeiros tinham recebido células pontuaram o movimento na escala SLR de 15 pontos, em que 15 é marcha normal e 0 a 4 é compromisso grave. Os cordeiros foram depois eutanasiados e a medula espinal lombar foi cortada em cinco a oito segmentos, corada e medida. Um neuropatologista, também sem conhecimento do grupo, contou as células nervosas motoras grandes por milímetro quadrado de substância cinzenta. Antes do estudo, os autores calcularam que grupos de três e seis cordeiros dariam uma potência de apenas 25,5%, o que significa que uma diferença real muito provavelmente não seria detetada.

Resultados:

Sobrevivência: foram criados defeitos em 11 fetos de cordeiro, em média aos 76,9 dias.

• Perderam-se três após a primeira operação. Uma ovelha teve deiscência da ferida com obstrução intestinal e foi eutanasiada, um feto morreu depois de a ovelha ter tido febre e um morreu no dia de uma complicação da ferida.
• Noutro cordeiro, o feto não pôde ser alcançado cirurgicamente, pelo que foram reparados sete cordeiros, em média aos 104,3 dias. Cinco receberam células e dois não.
• Mais quatro fetos morreram 11 a 17 dias após a reparação: três dos cinco cordeiros tratados e um dos dois não tratados. Um tinha um abcesso fúngico na coluna com infeção fúngica disseminada. A causa das outras mortes não foi clara.
• Nasceram vivos três cordeiros aos 144 a 147 dias: o cordeiro 1 (sem células) e os cordeiros 3 e 4 (com células). O artigo indica uma taxa global de nados-vivos de 30%.

Movimento (escala SLR, em 15):

• O cordeiro 1 (sem células) teve 15 às 2 horas e 15 às 48 horas.
• O cordeiro 3 (com células) teve 13 às 2 horas e 15 às 48 horas.
• O cordeiro 4 (com células) teve 15 às 2 horas e 15 às 48 horas.

Os três cordeiros andavam portanto normalmente às 48 horas, tivessem ou não recebido células, pelo que as pontuações não podiam mostrar qualquer benefício.

Tecido da medula espinal: não foi visto nenhum tumor em nenhum cordeiro, nem a olho nu nem ao microscópio.

• A densidade média de células nervosas grandes foi de 20,4 por mm² no cordeiro não tratado, contra 15 e 13,1 por mm² nos dois cordeiros tratados. Os autores referem que isto é o contrário do que estudos anteriores encontraram.
• A área média de substância cinzenta foi maior nos cordeiros tratados (274 e 218 unidades, contra 171 no cordeiro não tratado), e a proporção da medula constituída por substância cinzenta foi de 0,32 e 0,48, contra 0,31. Os autores sugerem que isto “poderia eventualmente indicar uma melhor preservação dos tecidos”.
• As áreas foram medidas em píxeis de imagem, e não foram apresentados testes estatísticos a comparar os cordeiros.

Conclusões:

Os autores concluem que é exequível aplicar um produto de CEM humanas do cordão umbilical durante a reparação fetal da espinha bífida em ovelhas, e que são necessários estudos maiores com o Desacell para testar o movimento, a proteção nervosa e a segurança.

O estudo é um primeiro passo técnico. Só puderam ser avaliados um cordeiro não tratado e dois tratados, pelo que os resultados não podem mostrar se as células funcionam. Os autores enumeram três limitações principais: a elevada mortalidade fetal, que eliminou qualquer possibilidade de uma comparação significativa e pode refletir problemas cirúrgicos não relacionados com as células; a ausência de colorações especiais (imuno-histoquímica), pelo que não puderam confirmar que as células ainda estavam presentes na zona reparada; e demasiado poucos sobreviventes para que as pontuações de movimento tenham significado. Além disso, o cordeiro não tratado andava normalmente, o que sugere que o defeito neste modelo não causou fraqueza duradoura nestes animais, e com um cordeiro por comparação as diferenças na substância cinzenta e nas células nervosas podem facilmente dever-se ao acaso. Não foram estudados resultados a longo prazo, como a função da bexiga ou a medula presa, porque os cordeiros só foram examinados até 48 horas após o nascimento.

Informação de contexto:

A espinha bífida afeta cerca de 1 em cada 2000 gravidezes na Europa. O ensaio MOMS mostrou que reparar o defeito antes do nascimento reduz para metade a necessidade de uma derivação do líquido cerebral e duplica a probabilidade de andar aos 30 meses, mas 58% das crianças reparadas antes do nascimento continuam sem conseguir andar de forma independente. Os investigadores esperam que acrescentar células estaminais no momento da reparação possa proteger ainda mais a medula espinal exposta.

O produto celular, Desacell, é descrito como um produto pronto a usar, fabricado com um protocolo de isolamento patenteado. O artigo não indica o fabricante nem o titular da patente. Os autores afirmam que foi testado em roedores e em babuínos prematuros, em adultos com insuficiência pulmonar grave (CIRCA-19), em bebés prematuros com risco de doença pulmonar crónica (HULC-1), e que está a ser estudado em adultos com choque sético (UC-CISS II). O estudo em babuínos que citam, liderado pelo coautor Möbius, tem o título “Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates”. Dois dos autores são do Saxonian Center for Feto/Neonatal Health da Technische Universität Dresden.

O estudo foi financiado pela Fundação Alemã de Investigação (DFG BA 7308/4-1). Os autores declaram não ter conflitos de interesse. O trabalho é apenas uma experiência em animais, e os autores apontam o ensaio CuRe em curso, que usa células da placenta num patch, como o primeiro estudo em humanos com células estaminais administradas durante a reparação fetal da espinha bífida.